甲氨蝶呤对二氢叶酸还原酶有强大而持久的抑制作用，使5，10-甲撑四氢叶酸不足，脱氧胸苷酸dTMP合成受阻，影响DNA合成，MTX也可阻止嘌呤核苷酸的合成，因为嘌呤环上的第2和第8碳原子是由FH4携带的一碳基团如-CHO-，=C-所供给，故能干扰RNA和蛋白质的合成。
甲氨蝶呤片主要治疗各种急性白血病，特别是急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤和蕈样肉芽肿，多发性骨髓病，头颈部癌，肺癌、各种软组织肉瘤、银屑病，乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、恶性葡萄胎，绒毛膜上皮癌，睾丸癌。
甲氨蝶呤片不是激素药。甲氨蝶呤是一种抗叶酸抗肿瘤药物，但同时它也是一种免疫抑制药物。临床上它可以用于急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤性等疾病的治疗，或者是应用于宫外孕保守治疗。
甲氨蝶呤片主要是治疗各型急性白血病，特别是急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓病；头颈部癌、肺癌、各种软组织肉瘤。除了服用期间控制自己的饮食以外，不能吃辛辣、油腻等食物，还应该注意甲氨蝶呤片有致突变性，致畸性和致癌性较烷化剂为轻，但长期服用后，有潜在的导致继发性肿瘤的危险，不要长时间的服用该药物。
甲氨蝶玲治疗银屑病的效果是比较显著的，可以用于治疗顽固的寻常型银屑病，既可以作为短期内应用控制脓疱型，红皮病型和关节型银屑病，又可作为长期维持治疗，口服、肌肉注射、静滴均可。
甲氨蝶呤可以用来治疗宫外孕，因为该药适用于早期的输卵管妊娠，要求是没有药物治疗禁忌症，输卵管妊娠未破裂或流产，输卵管妊娠包块直径不超过四厘米，无明显内出血。
